目前一代測(cè)序儀廠家主要有Illumina 、羅氏、ABI等三家。Illumina公司于2007年花費(fèi)6億美金的巨資收購(gòu)了Solexa， 新一代dna測(cè)序儀Genome Analyzer早由Solexa公司研發(fā)，利用其核心技術(shù)“DNA簇”和“可逆性末端終結(jié)（reversible terminator）”，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化樣本制備及基因組數(shù)百萬(wàn)個(gè)堿基大規(guī)模平行測(cè)序。。Genome Analyzer作為新一代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)，具有高性，高通量，高靈敏度，和低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢(shì)，可以同時(shí)完成傳統(tǒng)基因組學(xué)研究（測(cè)序和注釋）以及功能基因組學(xué) （基因表達(dá)及調(diào)控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。

    Genome Analyzer自以來(lái)，已經(jīng)為千人基因組計(jì)劃立下了赫赫戰(zhàn)功。今年早期，荷蘭科學(xué)家利用它繪出女性的基因組圖譜。而就在前兩周，《Nature》雜志上一連出現(xiàn)三個(gè)人類基因組圖譜：炎黃一號(hào)-*個(gè)亞洲人圖譜；*個(gè)癌癥病人圖譜；*個(gè)非洲人圖譜。它們?nèi)且蕾?/span>Genome Analyzer完成的。嘩，一下就來(lái)仨！這和*個(gè)人類基因組圖譜的13年形成了多么鮮明的對(duì)照。

根據(jù)去年底的數(shù)據(jù)，Genome Analyzer已售出約200臺(tái)，估計(jì)是*廣的。前不久，華大基因再添置了12臺(tái)，準(zhǔn)備放在香港和深圳的實(shí)驗(yàn)室，至此華大基因已經(jīng)有29臺(tái)Genome Analyzer。而的麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)Broad研究院擁有47臺(tái)Illumina測(cè)序儀。眾多實(shí)驗(yàn)室之所以選擇Illumina，看中的無(wú)疑是Genome Analyzer的高性價(jià)比。
上個(gè)月，Illumina將Genome Analyzer II升級(jí)到Genome Analyzer IIx，距年底實(shí)現(xiàn)單次運(yùn)行獲得95 GB數(shù)據(jù)的宏偉目標(biāo)又近了一步。Genome Analyzer IIx有兩個(gè)核心特征：其一是更大的試劑冷卻器，支持超過(guò)100個(gè)測(cè)序循環(huán)，進(jìn)一步提升了系統(tǒng)的易用性和自動(dòng)化；其二是的流動(dòng)池支架，讓每輪運(yùn)行所得的高質(zhì)量數(shù)據(jù)增加20%。依靠系統(tǒng)軟件和試劑的改進(jìn)，Genome Analyzer IIx現(xiàn)在能夠支持100 bp以上的配對(duì)末端讀長(zhǎng)，并在每次運(yùn)行中產(chǎn)生超過(guò)20 GB的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。
Genome Analyzer技術(shù)的基本原理：
1. 文庫(kù)制備
將基因組DNA打成幾百個(gè)堿基（或更短）的小片段，在片段的兩個(gè)末端加上接頭（adapter）。
2. 產(chǎn)生DNA簇
利用的芯片，其表面連接有一層單鏈引物，DNA片段變成單鏈后通過(guò)與芯片表面的引物堿基互補(bǔ)被一端“固定”在芯片上。另外一端（5’或3’）隨機(jī)和附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被“固定”住，形成“橋 （bridge） “。反復(fù)30輪擴(kuò)增，每個(gè)單分子得到了1000倍擴(kuò)增，成為單克隆DNA簇。DNA簇產(chǎn)生之后，擴(kuò)增子被線性化，測(cè)序引物隨后雜交在目標(biāo)區(qū)域一側(cè)的通用序列上。

3. 測(cè)序
Genome Analyzer系統(tǒng)應(yīng)用了邊合成邊測(cè)序（Sequencing By Synthesis）的原理。加入改造過(guò)的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP。 這些核苷酸是“可逆終止子”，因?yàn)?/span>3’羥基末端帶有可化學(xué)切割的部分，它只容許每個(gè)循環(huán)摻入單個(gè)堿基。此時(shí)，用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列*輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類。之后，將這些基團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù)3'端粘性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸。如此繼續(xù)下去，直到每條模板序列都被聚合為雙鏈。這樣，統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，就可以得知每個(gè)模板DNA片段的序列。目前的配對(duì)末端讀長(zhǎng)可達(dá)到2×50 bp，更長(zhǎng)的讀長(zhǎng)也能實(shí)現(xiàn)，但錯(cuò)誤率會(huì)增高。讀長(zhǎng)會(huì)受到多個(gè)引起信號(hào)衰減的因素所影響，如熒光標(biāo)記的不切割。

4. 數(shù)據(jù)分析
自動(dòng)讀取堿基，數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)移到自動(dòng)分析通道進(jìn)行二次分析。

Genome Analyzer系統(tǒng)之所以如此，關(guān)鍵在于其技術(shù)上的優(yōu)勢(shì)。
1. 可擴(kuò)展的超高通量
Genome Analyzer系統(tǒng)目前每次運(yùn)行后可獲得超過(guò)20 GB的高品質(zhì)過(guò)濾數(shù)據(jù)。這個(gè)技術(shù)的可擴(kuò)展性了更高的數(shù)據(jù)密度和輸出，能用更少的經(jīng)費(fèi)完成更復(fù)雜的項(xiàng)目。到今年底，通量還有望上升到95 GB，相當(dāng)于人類基因組的30倍覆蓋度。
2. 需要樣品量少
Genome Analyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至100ng，能應(yīng)用在很多樣品有限的實(shí)驗(yàn)（比如免疫沉淀、顯微切割等）中。這也是很多研究人員所考慮的因素。
3. 簡(jiǎn)單、快速、自動(dòng)化
Genome Analyzer系統(tǒng)提供了簡(jiǎn)單和簡(jiǎn)潔的工作流程。即使是小的實(shí)驗(yàn)室也能像大型基因組中心一樣進(jìn)行大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)。制備樣品文庫(kù)可以在幾小時(shí)內(nèi)完成，一個(gè)星期內(nèi)就能得到高度的數(shù)據(jù)。Cluster Station可以說(shuō)是Genome Analyzer的核心。由獨(dú)立軟件控制的自動(dòng)生成DNA簇的過(guò)程可以在5小時(shí)之內(nèi)（30分鐘手工操作）完成。這個(gè)自動(dòng)化的流程不需要進(jìn)行Emulsion PCR，減少了手工操作誤差和污染可能性，也不需要機(jī)器人操作或潔凈室。快速的實(shí)驗(yàn)流程使Genome Analyzer的能力增至大，而自動(dòng)化步移降低了項(xiàng)目的時(shí)間和費(fèi)用。
4. 新穎的測(cè)序化學(xué)技術(shù)
Genome Analyzer通過(guò)合成測(cè)序來(lái)支持大規(guī)模并行測(cè)序。利用新穎的可逆熒光標(biāo)記終止子，可以在DNA鏈延伸的過(guò)程中檢測(cè)單個(gè)堿基摻入。由于四個(gè)可逆終止子dNTP在每個(gè)測(cè)序循環(huán)都存在，自然的競(jìng)爭(zhēng)減少了摻入的誤差。
5. 單個(gè)或配對(duì)末端支持
Genome Analyzer系統(tǒng)支持單個(gè)片段或配對(duì)末端文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)單，減少了樣品分離和制備的時(shí)間。制備基因組DNA的單個(gè)片段或配對(duì)末端文庫(kù)需要6個(gè)小時(shí)，只有3個(gè)小時(shí)需要手工操作。2×50個(gè)堿基或更長(zhǎng)的讀長(zhǎng)增加了比對(duì)基因組的能力，并拓展了在其他方面的應(yīng)用。
然而，精明的用戶更看重的是性價(jià)比，這也是他們選擇Illumina的重要原因。Illumina的售價(jià)約為45萬(wàn)美元，低于454 GS FLX的50萬(wàn)和SOLiD系統(tǒng)的59萬(wàn)（以上皆為美國(guó)的售價(jià)）。此外，運(yùn)行成本也是一個(gè)關(guān)鍵因素。美國(guó)鳳凰城翻譯基因組學(xué)研究院（TGen）的主管David Duggan曾表示，當(dāng)年購(gòu)買新一代測(cè)序儀時(shí)，每次運(yùn)行的費(fèi)用就成為他下決定的主要因素。他終選擇了Illumina Genome Analyzer，因?yàn)槊枯喌倪\(yùn)行費(fèi)用為3000-4000美元（2007年的數(shù)據(jù)），較為合理，而其他測(cè)序儀可能更高。當(dāng)然，他也綜合考慮了通量、運(yùn)行時(shí)間和樣品量。
弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)的高原（音譯）博士認(rèn)為：“Genome Analyzer的操作費(fèi)用、易用性和可擴(kuò)展性讓我實(shí)現(xiàn)了大規(guī)?；蚪M實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)在，我的小型實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行過(guò)去只能在大型基因組中心才能完成的實(shí)驗(yàn)。低樣品需求、簡(jiǎn)單的流程、高質(zhì)量的數(shù)據(jù)以及應(yīng)用靈活性讓Illumina Genome Analyzer從其他高通量測(cè)序技術(shù)中脫穎而出。”

羅氏454 測(cè)序儀
454公司可謂新一代測(cè)序技術(shù)的奠基人。2005年底，454公司推出了的基于焦磷酸測(cè)序法的超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》雜志以里程碑事件報(bào)道，開(kāi)創(chuàng)了邊合成邊測(cè)序（sequencing-by-synthesis）的先河。之后，454公司被羅氏診斷公司以1.55億美元收購(gòu)。一年后，他們又推出了性能更優(yōu)的第二代基因組測(cè)序系統(tǒng)—— Genome Sequencer FLX System （GS FLX）。去年10月，的GS FLX Titanium系列試劑和軟件的補(bǔ)充，讓GS FLX的通量一下子提高了5倍，性、讀長(zhǎng)也進(jìn)一步提升。
想當(dāng)年，GS 20的出現(xiàn)，揭開(kāi)了測(cè)序歷嶄新的一頁(yè)。Jonathan Rothberg博士就是大規(guī)模并行測(cè)序的，同時(shí)也是454的創(chuàng)始人。上世紀(jì)90年代，很多學(xué)者也都想到了大規(guī)模并行測(cè)序，他們?cè)噲D將Sanger測(cè)序移到芯片上，但都以失敗告終，因?yàn)檫@項(xiàng)技術(shù)沒(méi)有可擴(kuò)展性。1999年，Rothberg的兒子出世，他放了兩個(gè)星期的陪產(chǎn)假。小家伙出生后被送入嬰兒特護(hù)病房，Rothberg非常擔(dān)心，甚至想獲取兒子的基因組信息。這段擔(dān)驚受怕的經(jīng)歷給了他靈感，他突然意識(shí)到焦磷酸測(cè)序（pyrosequencing）不僅簡(jiǎn)單，而且具有可擴(kuò)展性。兩個(gè)星期之后，Rothberg就開(kāi)始設(shè)計(jì)芯片和流動(dòng)室，讓測(cè)序在更小的反應(yīng)室中進(jìn)行，并同時(shí)進(jìn)行幾百萬(wàn)個(gè)反應(yīng)。

硬件的設(shè)計(jì)和制造也只是成功的一半，在樣品制備上還有同樣漫長(zhǎng)的路要走。Rothberg摒棄了傳統(tǒng)的細(xì)菌克隆與挑選，將DNA打斷成隨機(jī)片段，并尋找一種方法來(lái)克隆每個(gè)片段。受到其他學(xué)者乳液實(shí)驗(yàn)的啟發(fā)，他也想將DNA放入油包水的乳液中，這樣就省去了反應(yīng)管。一個(gè)好漢三個(gè)幫。在Joel Bader等人的幫助下，Rothberg驗(yàn)證了這些想法的可行性，并利用了*中的表面活性劑來(lái)維持乳液的熱穩(wěn)定性。就這樣，乳液PCR終于誕生了。
之后，454生命科學(xué)公司用新一代測(cè)序儀對(duì)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的James Watson進(jìn)行了基因組測(cè)序。*份個(gè)人基因組圖譜的繪制只用了兩年時(shí)間，花費(fèi)不到100萬(wàn)美元。雖然現(xiàn)在看來(lái)這并不算什么，但就當(dāng)時(shí)而言，它相對(duì)于人類基因組計(jì)劃已是質(zhì)的飛躍。
GS FLX系統(tǒng)的工作流程
GS FLX系統(tǒng)的流程概括起來(lái)，就是“一個(gè)片段 = 一個(gè)磁珠 = 一條讀長(zhǎng)（One fragment = One bead = One read）”。
1）樣品輸入并片段化：GS FLX系統(tǒng)支持各種不同來(lái)源的樣品，包括基因組DNA、PCR產(chǎn)物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。大的樣品例如基因組DNA或者BAC等被打斷成300－800 bp的片段；對(duì)于小分子的非編碼RNA或者PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，這一步則不需要。短的PCR產(chǎn)物則可以直接跳到步驟3）。
2）文庫(kù)制備：借助一系列標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，將A和B接頭（3’和5’端具有特異性）連接到DNA片段上。接頭也將用于后續(xù)的純化，擴(kuò)增和測(cè)序步驟。具有A、B接頭的單鏈DNA片段組成了樣品文庫(kù)。
3）一個(gè)DNA片段＝一個(gè)磁珠：?jiǎn)捂?/span>DNA文庫(kù)被固定在特別設(shè)計(jì)的DNA捕獲磁珠上。每一個(gè)磁珠攜帶了一個(gè)*的單鏈DNA片段。磁珠結(jié)合的文庫(kù)被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了只包含一個(gè)磁珠和一個(gè)*片段的微反應(yīng)器。
4）乳液PCR擴(kuò)增：每個(gè)*的片段在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而沒(méi)有其他的競(jìng)爭(zhēng)性或者污染性序列的影響。整個(gè)片段文庫(kù)的擴(kuò)增平行進(jìn)行。對(duì)于每一個(gè)片段而言，擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬(wàn)個(gè)相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增的片段仍然結(jié)合在磁珠上。

5）一個(gè)磁珠＝一條讀長(zhǎng)：攜帶DNA的捕獲磁珠隨后放入PTP板中進(jìn)行后繼的測(cè)序。PTP孔的直徑（29um）只能容納一個(gè)磁珠（20um）。然后將PTP板放置在GS FLX中，測(cè)序開(kāi)始。放置在四個(gè)單獨(dú)的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入PTP板，每次只進(jìn)入一個(gè)堿基。如果發(fā)生堿基配對(duì)，就會(huì)釋放一個(gè)焦磷酸。這個(gè)焦磷酸在ATP硫酸化酶和螢光素酶的作用下，經(jīng)過(guò)一個(gè)合成反應(yīng)和一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，終將螢光素氧化成氧化螢光素，同時(shí)釋放出光信號(hào)。此反應(yīng)釋放出的光信號(hào)實(shí)時(shí)被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個(gè)堿基和測(cè)序模板進(jìn)行配對(duì)，就會(huì)捕獲到一分子的光信號(hào)；由此一一對(duì)應(yīng)，就可以、快速地確定待測(cè)模板的堿基序列。這也就是大名鼎鼎的焦磷酸測(cè)序。

6）數(shù)據(jù)分析：GS FLX系統(tǒng)在10小時(shí)的運(yùn)行當(dāng)中可獲得100多萬(wàn)個(gè)讀長(zhǎng)，讀取超過(guò)4-6億個(gè)堿基信息。GS FLX 系統(tǒng)提供兩種不同的生物信息學(xué)工具對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，適用于不同的應(yīng)用：達(dá)400 MB的從頭拼接和任何大小基因組的重測(cè)序。
GS FLX系統(tǒng)的率在99%以上。其主要限制來(lái)自同聚物，也就是相同堿基的連續(xù)摻入，如AAA或GGG。由于沒(méi)有終止元件來(lái)阻止單個(gè)循環(huán)的連續(xù)摻入，同聚物的長(zhǎng)度就需要從信號(hào)強(qiáng)度中推斷出來(lái)。這個(gè)過(guò)程就可能產(chǎn)生誤差。因此，454測(cè)序平臺(tái)的主要錯(cuò)誤類型是插入-缺失，而不是替換。


新升級(jí)讓性能提升
去年底發(fā)布的Titanium系列試劑，是對(duì)現(xiàn)有GS FLX平臺(tái)的重要升級(jí)。升級(jí)內(nèi)容包含耗材、試劑和軟件。你無(wú)需對(duì)儀器的硬件做任何昂貴的升級(jí)，只改進(jìn)試劑和軟件，就能立刻實(shí)現(xiàn)性能提升。升級(jí)之后，每輪測(cè)序能產(chǎn)生100萬(wàn)個(gè)讀長(zhǎng)片段，高質(zhì)量（Q20）的讀長(zhǎng)增加至400 bp。第400個(gè)堿基的率是99%，之前的更高。通量也提高了5倍，目前每輪運(yùn)行能獲得4-6億個(gè)堿基對(duì)，所需時(shí)間為10小時(shí)。
  PTP平板的創(chuàng)新重設(shè)計(jì)  重新設(shè)計(jì)之后，PTP平板上孔的密度更高，利用更小的DNA捕獲磁珠進(jìn)行金屬覆蓋，改善了信號(hào)質(zhì)量，因此讀長(zhǎng)的數(shù)量和長(zhǎng)度都明顯改善，同時(shí)性更高。目前孔的直徑是29 um，DNA捕獲磁珠的大小是20 um。
  改進(jìn)的測(cè)序試劑  改進(jìn)的GS FLX Titanium試劑顯著降低了背景噪音，因此在幾乎相同的運(yùn)行時(shí)間內(nèi)，讀長(zhǎng)更加長(zhǎng)。升級(jí)的軟件  優(yōu)化用于超高通量測(cè)序的軟件，能輕松對(duì)更大、更復(fù)雜的基因組進(jìn)行拼接和作圖。GS FLX 2.0版  它與以前版本的輸出數(shù)據(jù)也兼容，讓片段能夠共同拼接和作圖。
廣闊的應(yīng)用天地
在新一代測(cè)序技術(shù)中，GS系統(tǒng)是多產(chǎn)的。截至2008年9月，已經(jīng)發(fā)表了250多篇高質(zhì)量的paper。其中Nature 20篇、Science 13篇、Cell 6篇、Genome Research 20篇、PNAS 24篇。光是這些數(shù)據(jù)就讓人咂舌。這些研究跨越了測(cè)序應(yīng)用的多個(gè)方面：82篇全基因組測(cè)序論文包括比較基因組學(xué)的從頭測(cè)序和重測(cè)序；54篇小分子RNA研究；37篇聚焦快速興起的宏基因組學(xué)；27篇關(guān)于轉(zhuǎn)錄組圖譜分析，包括全轉(zhuǎn)錄組拼接和表達(dá)圖譜；13篇研究染色體結(jié)構(gòu)和表觀遺傳學(xué)；10篇有關(guān)稀有變異檢測(cè)的超深度測(cè)序這個(gè)新領(lǐng)域；11篇研究古老RNA。其余的文章關(guān)注454測(cè)序系統(tǒng)的技術(shù)和生物信息學(xué)。多種多樣的應(yīng)用彰顯出454測(cè)序系統(tǒng)的能力，那些傳統(tǒng)意義上無(wú)法用測(cè)序來(lái)解決的問(wèn)題現(xiàn)在也一并解決了。
454測(cè)序系統(tǒng)除了為多項(xiàng)研究領(lǐng)域開(kāi)辟了基因組分析之路，同時(shí)也加速了探索的步伐。一般來(lái)說(shuō)，研究、分析、撰寫(xiě)并提交論文，經(jīng)同行評(píng)議后發(fā)表，需要一年左右的時(shí)間。而利用Genome Sequencer系統(tǒng)發(fā)表論文的速度，顯然表明454測(cè)序結(jié)果的數(shù)據(jù)質(zhì)量高，且分析簡(jiǎn)單。超長(zhǎng)讀長(zhǎng)與易用的分析工具相結(jié)合，讓研究人員能更集中精力于科學(xué)研究，而不是研究測(cè)序過(guò)程中的某個(gè)技術(shù)細(xì)節(jié)。這樣研究項(xiàng)目能快速完成，接著踏上新的研究道路。
與其他新一代測(cè)序平臺(tái)相比，454平臺(tái)的突出優(yōu)勢(shì)是讀長(zhǎng)。目前GS FLX系統(tǒng)的序列讀長(zhǎng)已超過(guò)400 bp。雖然454平臺(tái)的測(cè)序成本比其他平臺(tái)要高很多，不過(guò)對(duì)于那些需要長(zhǎng)讀長(zhǎng)的應(yīng)用，如從頭拼接和宏基因組學(xué)，它仍是的選擇。
去年底，美國(guó)加利福尼亞大學(xué)的研究小組利用的GS FLX Titanium系列試劑對(duì)海洋樣品的宏基因組進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了一種的藍(lán)藻物種，文章發(fā)表在11月14日的《Science》雜志上。這項(xiàng)研究是系統(tǒng)升級(jí)后發(fā)表的首篇文章。研究員Jonathan Zehr對(duì)于獲得數(shù)據(jù)及分析結(jié)果的速度非常震驚。他表示：“多年來(lái)我們一直試圖培養(yǎng)這種微生物，但都沒(méi)有成功。有了GS FLX Titanium，我們?cè)趲滋熘畠?nèi)就通過(guò)單次測(cè)序運(yùn)行，從環(huán)境樣品直接獲得了寶貴的基因組信息。這個(gè)系統(tǒng)超長(zhǎng)的讀長(zhǎng)對(duì)于我們從復(fù)雜的微生物群體中鑒定并分析這種*的細(xì)菌基因組來(lái)說(shuō)非常關(guān)鍵。”
近，在454測(cè)序平臺(tái)的協(xié)助下，研究人員完成了油棕櫚的全基因組測(cè)序、拼接和注釋。油棕櫚是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，它的基因組很大，達(dá)17 GB。基因組的測(cè)序工作是由GS FLX Titanium系統(tǒng)完成的，拼接和分析則是由馬來(lái)西亞一家生物信息學(xué)公司完成的。值得注意的是，這是*次在沒(méi)有添加傳統(tǒng)Sanger測(cè)序數(shù)據(jù)的情況下，完成了對(duì)大且非常復(fù)雜的植物基因組進(jìn)行從頭拼接。這種快速經(jīng)濟(jì)的方法為了解多種經(jīng)濟(jì)作物的遺傳結(jié)構(gòu)打開(kāi)了大門。
此外，羅氏旗下的另一家公司NimbleGen正在性地捕獲定向重測(cè)序市場(chǎng)。NimbleGen序列捕獲芯片與454的測(cè)序儀結(jié)合，能讓完整的人外顯組測(cè)序成為現(xiàn)實(shí)，終將為研究流水線輸送技術(shù)，并促進(jìn)個(gè)性化醫(yī)療的開(kāi)發(fā).
ABI測(cè)序儀
過(guò)去20年，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）在測(cè)序方面一直占據(jù)著壟斷地位。自公司的共同創(chuàng)始人Leroy Hood在上世紀(jì)80年代中期設(shè)計(jì)了*臺(tái)自動(dòng)熒光測(cè)序儀之后，生命科學(xué)研究就擺脫了手工測(cè)序的繁瑣和辛勞，驕傲地邁入自動(dòng)測(cè)序的新時(shí)代。直到2005年，454推出了FLX焦磷酸測(cè)序平臺(tái)，ABI的地位開(kāi)始有些動(dòng)搖。之后，ABI迅速收購(gòu)了一家測(cè)序公司——Agencourt Personal Genomics，并在2007年底推出了SOLiD 新一代測(cè)序平臺(tái)。從SOLiD到如今的SOLiD 3，短短一年多時(shí)間，它已經(jīng)上演了一出精彩的“方程式賽車”。
SOLiD全稱為supported oligo ligation detetion，它的*之處在于以四色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連續(xù)連接合成為基礎(chǔ)，取代了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)，可對(duì)單拷貝DNA片段進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增和高通量并行測(cè)序。就通量而言，SOLiD 3系統(tǒng)是的，目前SOLiD 3單次運(yùn)行可產(chǎn)生50GB的序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于17倍人類基因組覆蓋度。而其無(wú)以倫比的性、系統(tǒng)可靠性和可擴(kuò)展性更讓它從其他新一代測(cè)序平臺(tái)中脫穎而出。為什么SOLiD能輕松實(shí)現(xiàn)貌似不可能的任務(wù)？讓生物通帶你從測(cè)序原理入手，一探究竟。

SOLiD工作流程
a. 文庫(kù)制備
SOLiD系統(tǒng)能支持兩種測(cè)序模板：片段文庫(kù)（fragment library）或配對(duì)末端文庫(kù)（mate-paired library）。使用哪一種文庫(kù)取決于你的應(yīng)用及需要的信息。片段文庫(kù)就是將基因組DNA打斷，兩頭加上接頭，制成文庫(kù)。如果你想要做轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、RNA定量、miRNA探索、重測(cè)序、3’, 5’-RACE、甲基化分析、ChIP測(cè)序等，就可以用它。如果你的應(yīng)用是全基因組測(cè)序、SNP分析、結(jié)構(gòu)重排/拷貝數(shù)，則需要用配對(duì)末端文庫(kù)。配對(duì)末端文庫(kù)是將基因組DNA打斷后，與中間接頭連接，再環(huán)化，然后用EcoP15酶切，使中間接頭兩端各有27bp的堿基，再加上兩端的接頭，形成文庫(kù)。
b. 乳液PCR/微珠富集
在微反應(yīng)器中加入測(cè)序模板、PCR反應(yīng)元件、微珠和引物，進(jìn)行乳液PCR（Emulsion PCR）。PCR完成之后，變性模板，富集帶有延伸模板的微珠，去除多余的微珠。微珠上的模板經(jīng)過(guò)3’修飾，可以與玻片共價(jià)結(jié)合?？吹竭@里，是不是有一種似曾相識(shí)的感覺(jué)呢？那就對(duì)了，此步驟與454的GS FLX基本相同。不過(guò)SOLiD系統(tǒng)的微珠要小得多，只有1 um。
乳液PCR大的特點(diǎn)是可以形成數(shù)目龐大的獨(dú)立反應(yīng)空間以進(jìn)行DNA擴(kuò)增。其關(guān)鍵技術(shù)是“注水到油”，基本過(guò)程是在PCR反應(yīng)前，將包含PCR所有反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，水溶液瞬間形成無(wú)數(shù)個(gè)被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構(gòu)成了獨(dú)立的PCR反應(yīng)空間。理想狀態(tài)下，每個(gè)小水滴只含一個(gè)DNA模板和一個(gè)P1磁珠，由于水相中的P2引物和磁珠表面的P1引物所介導(dǎo)的PCR反應(yīng)，這個(gè)DNA模板的拷貝數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增加，PCR反應(yīng)結(jié)束后，P1磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目巨大的同來(lái)源DNA模板擴(kuò)增產(chǎn)物。
c. 微珠沉積
3’修飾的微珠沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過(guò)程中，沉積小室將每張玻片分成1個(gè)、4個(gè)或8個(gè)測(cè)序區(qū)域。SOLiD系統(tǒng)大的優(yōu)點(diǎn)就是每張玻片能容納更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實(shí)現(xiàn)更高的通量。
d. 連接測(cè)序
這一步可就是SOLiD的了。它的*之處在于沒(méi)有采用慣常的聚合酶，而用了連接酶。SOLiD連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物。連接反應(yīng)中，這些探針按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對(duì)。探針的5’末端分別標(biāo)記了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM這4種顏色的熒光染料。探針3’端1～5位為隨機(jī)堿基，可以是ATCG四種堿基中的任何一種堿基，其中第1、2位構(gòu)成的堿基對(duì)是表征探針染料類型的編碼區(qū)，下圖的雙堿基編碼矩陣規(guī)定了該編碼區(qū)16種堿基對(duì)和4種探針顏色的對(duì)應(yīng)關(guān)系，而3～5位的“n”表示隨機(jī)堿基，6～8位的“z”指的是可以和任何堿基配對(duì)的特殊堿基。

單向SOLiD測(cè)序包括五輪測(cè)序反應(yīng)，每輪測(cè)序反應(yīng)含有多次連接反應(yīng)。*輪測(cè)序的*次連接反應(yīng)由連接引物“n”介導(dǎo)，由于每個(gè)磁珠只含有均質(zhì)單鏈DNA模板，所以這次連接反應(yīng)摻入一種8堿基熒光探針，SOLiD測(cè)序儀記錄下探針第1、2位編碼區(qū)顏色信息，隨后的化學(xué)處理斷裂探針3’端第5、6位堿基間的化學(xué)鍵，并除去6~8位堿基及5’末端熒光基團(tuán)，暴露探針第5位堿基5’磷酸，為下一次連接反應(yīng)作準(zhǔn)備。因?yàn)?次連接反應(yīng)使合成鏈多了5個(gè)堿基，所以第二次連接反應(yīng)得到模板上第6、7位堿基序列的顏色信息，而第三次連接反應(yīng)得到的是第11、12位堿基序列的顏色信息……

幾個(gè)循環(huán)之后，引物重置，開(kāi)始第二輪的測(cè)序。由于第二輪連接引物n-1比*輪錯(cuò)開(kāi)一位，所以第二輪得到以0，1位起始的若干堿基對(duì)的顏色信息。五輪測(cè)序反應(yīng)反應(yīng)后，按照第0、1位，第1、2位... …的順序把對(duì)應(yīng)于模板序列的顏色信息連起來(lái)，就得到由“0，1，2，3…”組成的SOLiD原始顏色序列。

e. 數(shù)據(jù)分析
SOLiD測(cè)序完成后，獲得了由顏色編碼組成的SOLiD原始序列。理論上來(lái)說(shuō)，按照“雙堿基編碼矩陣”，只要知道所測(cè)DNA序列中任何一個(gè)位置的堿基類型，就可以將SOLiD原始顏色序列“解碼”成堿基序列。但由于雙堿基編碼規(guī)則中雙堿基與顏色信息的簡(jiǎn)并特性（一種顏色對(duì)應(yīng)4種堿基對(duì)），前面堿基的顏色編碼直接影響緊跟其后堿基的解碼，所以一個(gè)錯(cuò)誤顏色編碼就會(huì)引起“連鎖解碼錯(cuò)誤”，改變錯(cuò)誤顏色編碼之后的所有堿基。
和其它所有測(cè)序儀一樣，測(cè)序錯(cuò)誤在所難免，關(guān)鍵是對(duì)測(cè)序錯(cuò)誤的評(píng)價(jià)和后續(xù)處理。由于SOLiD系統(tǒng)采用了雙堿基編碼技術(shù)，在測(cè)序過(guò)程中對(duì)每個(gè)堿基判讀兩遍，從而減少原始數(shù)據(jù)錯(cuò)誤，提供內(nèi)在的校對(duì)功能。這樣，雙保險(xiǎn)確保了SOLiD系統(tǒng)原始?jí)A基數(shù)據(jù)的度大于99.94%，而在15X覆蓋率時(shí)的度可以達(dá)到99.999%，是目前新一代基因分析技術(shù)中度高的。
為避免“連鎖解碼錯(cuò)誤”的發(fā)生，SOLiD數(shù)據(jù)分析軟件不直接將SOLiD原始顏色序列解碼成堿基序列，而是依靠reference序列進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。SOLiD序列分析軟件首先根據(jù)“雙堿基編碼矩陣”把reference堿基序列轉(zhuǎn)換成顏色編碼序列，然后與SOLiD原始顏色序列進(jìn)行比較，來(lái)獲得SOLiD原始顏色序列在reference的位置，及兩者的匹配性信息。Reference轉(zhuǎn)換而成的顏色編碼序列和SOLiD原始序列的不匹配主要有兩種情況：“單顏色不匹配”和“兩連續(xù)顏色不匹配”。由于每個(gè)堿基都被獨(dú)立地檢測(cè)兩次，且SNP位點(diǎn)將改變連續(xù)的兩個(gè)顏色編碼，所以一般情況下SOLiD將單顏色不匹配處理成測(cè)序錯(cuò)誤，這樣一來(lái)，SOLiD分析軟件就完成了該測(cè)序錯(cuò)誤的自動(dòng)校正；而連續(xù)兩顏色不匹配也可能是連續(xù)的兩次測(cè)序錯(cuò)誤，SOLiD分析軟件將綜合考慮該位置顏色序列的一致性及質(zhì)量值來(lái)判斷該位點(diǎn)是否為SNP。
在初步了解了SOLiD系統(tǒng)的工作原理之后，我們才能明白它的魅力所在。
系統(tǒng)可擴(kuò)展性
SOLiD系統(tǒng)采用開(kāi)放玻片式的結(jié)構(gòu)，使用包被DNA樣品的微珠來(lái)輸入基因組信息。微珠密度并不是一成不變的，系統(tǒng)支持更高密度的微珠富集。開(kāi)放式玻片形式、微珠富集、以及軟件算法的結(jié)合，能使平臺(tái)輕松升級(jí)到更高的通量，而無(wú)需對(duì)基礎(chǔ)技術(shù)和配置做重大改變。這也是SOLiD系統(tǒng)平均每季度將通量擴(kuò)大一倍的原因所在。
無(wú)以倫比的通量
目前SOLiD 3系統(tǒng)單次運(yùn)行能產(chǎn)生50 GB的人基因組序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于基因組的17倍覆蓋度，這顯然是其他任一臺(tái)新一代測(cè)序系統(tǒng)都無(wú)法達(dá)到的。今年初，ABI公司和貝勒醫(yī)學(xué)院人類基因組測(cè)序中心（HGSC）的科學(xué)家總結(jié)了他們?cè)谇嘶蚪M計(jì)劃數(shù)據(jù)發(fā)布中的貢獻(xiàn)。作為商業(yè)參與者以及與HGSC共同協(xié)作，ABI公司利用SOLiD系統(tǒng)產(chǎn)生了超過(guò)460 GB可作圖的序列數(shù)據(jù)，比這兩個(gè)機(jī)構(gòu)的預(yù)定目標(biāo)高出了65%。而通量的升高也有望進(jìn)一步降低基因組測(cè)序的費(fèi)用，成本只需1萬(wàn)美元的人類基因組測(cè)序指日可待。
大的靈活性
SOLiD 3系統(tǒng)具有兩個(gè)獨(dú)立的流動(dòng)室，讓用戶能在一臺(tái)SOLiD分析儀中運(yùn)行兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)——同時(shí)提供兩套儀器。玻片也能分成1個(gè)、4個(gè)或8個(gè)小室。而20個(gè)條形碼序列則提供了額外的靈活性，顯著增加了定向重測(cè)序、表達(dá)和ChIP分析的經(jīng)濟(jì)性。目前多能同時(shí)運(yùn)行320個(gè)樣品（2×8×20）。
至此，SOLiD系統(tǒng)已不再是一臺(tái)單純的測(cè)序儀，而是成為功能更的基因分析儀。除了測(cè)序和重測(cè)序，還能進(jìn)行全基因表達(dá)圖譜分析、SNP、microRNA、ChIP、甲基化等多種分析。
全基因表達(dá)圖譜分析
芯片大概是目前應(yīng)用廣泛的從全局角度分析基因表達(dá)整體模式的方法。然而，基于雜交技術(shù)的微陣列技術(shù)只限用于已知序列，無(wú)法檢測(cè)新的mRNA；而且雜交技術(shù)靈敏度有限，難以檢測(cè)低豐度的目標(biāo)（需要更多的樣品量），難以檢測(cè)重復(fù)序列；也無(wú)法捕捉到目的基因表達(dá)水平的微小變化------而這恰恰是研究在刺激下或環(huán)境變化時(shí)的生物反應(yīng)所必需的。
與芯片技術(shù)相比，基于測(cè)序的高靈敏SOLiD技術(shù)可對(duì)單個(gè)細(xì)胞和癌癥樣品中存在的痕量RNA進(jìn)行整體的全基因組表達(dá)圖譜分析，每次運(yùn)行能定位高達(dá)2億4千萬(wàn)個(gè)標(biāo)簽（mRNA的相對(duì)表達(dá)水平可通過(guò)系統(tǒng)產(chǎn)生的序列標(biāo)簽數(shù)目來(lái)計(jì)算），可檢測(cè)低至每個(gè)細(xì)胞中10-40pg的總RNA，即使mRNA表達(dá)水平很低，SOLiD系統(tǒng)也能夠無(wú)偏向性地分析樣品中存在的已知和未知mRNA，從而定量特定mRNA的差異表達(dá)模式。起始樣品比微陣列技術(shù)要少得多，尤其適用于來(lái)源極為有限的生物樣品分析，如癌癥干細(xì)胞----分析其基因和非編碼RNA的表達(dá)圖譜有助于有助于加速發(fā)掘潛在的生物標(biāo)志物，從而更區(qū)分不同的疾病類型以及識(shí)別疾病易感性，幫助于研究人員更好地了解病變細(xì)胞的特性。
更多RNA研究
除了單細(xì)胞基因表達(dá)圖譜分析，SOLiD系統(tǒng)在RNA方面的其他應(yīng)用還包括利用SOLiD Small RNA Expression Kit來(lái)發(fā)現(xiàn)和篩選小分子RNA，實(shí)現(xiàn)在無(wú)需預(yù)先知道序列信息的情況下高通量發(fā)現(xiàn)新的RNA分子。這個(gè)方案有望顯著地提高研究人員鑒別小分子RNA的能力，將過(guò)去不可能完成的實(shí)驗(yàn)變?yōu)榭赡?。目前已發(fā)現(xiàn)的microRNAs還非常有限，SOLiD可在不知道目標(biāo)分子DNA序列的情況下進(jìn)行檢測(cè)和定量小的RNA分子，可將樣品制備工作從常規(guī)方法的四天縮短為僅需一天，是分析在生物樣品中表達(dá)的已知和未知miRNA及其它小分子RNAs的有效工具。利用SOLiD Whole Transcriptome Kit還可以探索和鑒定全轉(zhuǎn)錄本。SOLiD*的高通量和測(cè)序數(shù)據(jù)的高性使得可以用短序列讀長(zhǎng)即可測(cè)序整個(gè)轉(zhuǎn)錄組。了解轉(zhuǎn)錄組對(duì)有助于解開(kāi)導(dǎo)致復(fù)雜疾病的分子通路的秘密。這一系列應(yīng)用補(bǔ)充使研究人員能在單個(gè)超高通量平臺(tái)上開(kāi)展綜合的RNA研究。
SNP分析
盡管絕大多數(shù)的人類遺傳信息在所有人中都相同，但是研究人員通常更感興趣的是研究個(gè)體之間微小的遺傳差異。這種差異包括單堿基變異，以及被稱為結(jié)構(gòu)變異的各種較大片段DNA序列變異。結(jié)構(gòu)變異包括DNA片段的插入、缺失、倒位和易位，結(jié)構(gòu)變異的DNA片段范圍可從幾個(gè)堿基對(duì)到數(shù)百萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)，可能對(duì)基因產(chǎn)生重要影響，并導(dǎo)致人類疾病的發(fā)生。SOLiD流程獲得的嚴(yán)密的片段范圍，使研究人員可以鑒別出很寬范圍內(nèi)的插入和缺失片段，結(jié)構(gòu)重排也能很容易鑒別出來(lái)。這個(gè)平臺(tái)的超高通量使研究人員可輕而易舉地獲得高度基因組覆蓋率的數(shù)據(jù)，鑒定個(gè)體基因組中存在的數(shù)百萬(wàn)個(gè)單堿基多態(tài)性SNP，揭示此前未知、具有潛在醫(yī)學(xué)價(jià)值的遺傳變異，從而促進(jìn)我們對(duì)正常/疾病狀態(tài)下DNA結(jié)構(gòu)變異的了解，以及在更高的分辨率下對(duì)結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行深入分析，解釋個(gè)體之間的易感性差異和對(duì)疾病治療應(yīng)答的差異，終實(shí)現(xiàn)個(gè)性化醫(yī)療。
甲基化分析
甲基化是自然發(fā)生的DNA化學(xué)修飾的一種。已知抑癌基因的失活與DNA序列特定區(qū)域的甲基化有關(guān)。而去甲基化則可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和表達(dá)模式變化。DNA甲基化區(qū)域可能作為基因在癌癥過(guò)程中的標(biāo)記。研究人員一直研究從正常到癌變過(guò)程中甲基化模式如何變化的，原癌基因異常甲基化模式在癌變過(guò)程中扮演怎樣的角色。SOLiD系統(tǒng)運(yùn)行通量非常驚人，很快就可以做多個(gè)樣本全基因組甲基化模式檢測(cè)，使得研究人員可以鑒別基因組中對(duì)應(yīng)元件的甲基化狀態(tài)，從而幫助研究人員檢測(cè)甲基化模式是否可以作為癌癥的生物標(biāo)識(shí)，以及更好了解甲基化在癌變過(guò)程中扮演的角色。